Homologinė ar variantinė revakcinacija po Ad26.COV2.S imunizacijos sustiprina SARS-CoV-2 specifinį imuninį atsaką rezus makakose

Homologinė ar variantinė revakcinacija po Ad26.COV2.S imunizacijos sustiprina SARS-CoV-2 specifinį imuninį atsaką rezus makakose
Švieži PBMC buvo nudažyti Aqua gyvais / negyvais dažais 20 minučių, plaunami 2% FBS / DPBS buferiu, o ląstelės buvo suspenduotos 2% FBS / DPBS buferyje su Fc Block (BD Biosciences) 10 minučių. Po blokavimo mėginiai buvo nudažyti monokloniniais antikūnais prieš CD45 (klonas D058-1283, briliantinis ultravioletinis (BUV) 805, 1:300), CD3 (klonas SP34.2, alofikocianinas (APC) -Cy7, 1:30), CD7 klonas. M-T701, Alexa Fluor700, 1:30), CD123 (klonas 6H6, Alexa Fluor 700, 1:30), CD11c (klonas 3.9, Alexa Fluor 700, 1:30), CD19 (klonas J3-119, fikoeritrinas) , 1:20), CD20 (klonas 2H7, PE-Cy5, 1: 100), IgA (ožkos polikloniniai antikūnai, APC, 1:90), IgG (klonas G18-145, BUV737, 1:70), IgM (klonas G20-127, BUV395, 1:70), CD80 (klonas L307.4, briliantinis violetinis (BV) 786, 1:40), CD95 (klonas DX2, BV711, 1:90), CD27 (klonas M-T271, BUV563 , 1: 170), CD21 (klonas B-ly4, BV605, 1: 170), CD14 (klonas M5E2, BV570, 1:70), CD138 (klonas DL-101, PE-CF594, 1:30), CD31 ( klonas WM59, BV785, 1:30). Mėginiai taip pat buvo nudažyti SARS-CoV-2 antigenais, įskaitant biotiniluotus SARS-CoV-2 (WA1 / 2020) RBD baltymus (Sino Biological, 12,5 μg / ml), viso ilgio SARS-CoV-2 (WA1 / 2020) smaigalį baltymai (Sino Biological, 12,5 μg / ml), pažymėti fluoresceino izotiocianatu (FITC), SARS-CoV-2 (B.1.351) RBD baltymai (Sino Biological, 12,5 μg / ml), pažymėti APC ir DyLight 405. Dažymas atliktas 4 °C temperatūroje 30 min. Po dažymo ląstelės du kartus plaunamos 2% FBS / DPBS buferiu, po to inkubuojamos su BV650 streptavidinu (BD Pharmingen) 10 minučių, po to du kartus plaunamos 2% FBS / DPBS buferiu. Intraląsteliniam dažymui ląstelės buvo permeabilizuotos naudojant Caltag Fix & Perm (Thermo Fisher Scientific), tada nudažytos monokloniniais antikūnais prieš Ki67 (klonas B56, peridinino chlorofilo baltymas (PerCP) -Cy5.5, 1:40) ir IRF4 (klonas 3E4, PE-Cy7, 1:120). Po dažymo ląstelės buvo plaunamos ir fiksuojamos 2% paraformaldehidu. Visi duomenys buvo gauti naudojant BD FACSymphony srauto citometrą. Tolesnės analizės buvo atliktos naudojant FlowJo programinę įrangą (BD Bioscience, v.9.9.6). Atliekant analizę pavieniuose vartuose negyvos ląstelės buvo pašalintos Aqua dažais, o CD45 buvo naudojamas kaip teigiamas visų leukocitų įtraukimo užtvaras. Klasėmis pakeistose B ląstelių populiacijose, priskirtose kaip CD20+IgG+IgMCD3CD14CD11cCD123CD7, SARS-CoV-2 WA1 / 2020 UBR specifinės B ląstelės buvo identifikuotos kaip dvigubai teigiamos SARS-CoV-2 (WA1 / 2020) UBR ir smaigalių baltymams bei SARS-CoV-2 (B.1.351) specifiniams UBR B ląstelės buvo identifikuotos kaip dvigubai teigiamos SARS-CoV-2 (B.1.351) UBR baltymams, pažymėtiems skirtingais fluorescenciniais zondais. SARS-CoV-2 specifinės B ląstelės buvo toliau atskirtos pagal CD21 ir CD27 fenotipų pasiskirstymą, kaip buvo pranešta anksčiau (6, 35): aktyvuotos atminties B ląstelės (CD21CD27+) ir ramybės atminties B ląstelės (CD21+CD27+). Antikūnus išskiriančiose plazmos ląstelėse, uždarytose kaip CD20CD19+CD138+CD31+IgMIgG+ (26), SARS-CoV-2 UBR specifinės plazmos ląstelės buvo identifikuotos kaip dvigubai teigiamos SARS-CoV-2 (WA1 / 2020) UBR ir smaigalių baltymams.

Leave a Comment

Your email address will not be published.